Einen Einblick in die protospacer adjacent motif von Streptococcus pyogenes Cas9 mit künstlich stimuliert RNA-guided Cas9 DNA-Spaltung Flexibilität – RSC Advances (RSC Publishing)

xmlns=“http://www.rsc.org/schema/rscart38″>Das CRISPR (clustered regelmäßig interspaced kurze Palindrom-Wiederholungen)-associated (Cas) protein, Cas9, ist eine RNA-gesteuerte endonuklease, die verwendet RNA–DNA-Basenpaarung zu erkennen und zu Spalten doppelsträngige DNA (dsDNA) mit einem protospacer adjacent motif (PAM)., Es ist allgemein anerkannt, dass das am häufigsten verwendete Streptococcus pyogenes Cas9 (SpyCas9)-Protein eine kanonische 5′-NGG-3′ – Sequenz in der PAM erkennt. In dieser Studie entdeckten wir ein weiteres kritisches Merkmal, das für die SpyCas9-Spaltung erforderlich ist, nämlich den Zwischenraum zwischen dem Protospacer und NGG. Die Ergebnisse von DNA-Spalt-Assays zeigten, dass sowohl die Interraumlänge als auch das Vorhandensein eines GG-Dinukleotids (insbesondere des Upstream-Guanosins) kritische Komponenten bei der Ermöglichung einer SpyCas9-vermittelten Spaltung sind., Interessanterweise beeinflusst die Zwischenraumlänge signifikant die Auswahl von SpyCas9-Spaltstellen auf dem nicht komplementären Strang. Zusätzlich wird die komplementäre Strangspaltungsstelle durch den Ort der Single-Molecular Guide RNA (sgRNA) bestimmt. Dies zeigt an, dass PAM und sgRNA unterschiedliche Rollen bei der Bestimmung der SpyCas9-spezifischen Spaltstelle spielen. Wichtig ist, dass wir auch zum ersten Mal gezeigt haben, dass das In-vitro-Glühen von dsDNA mit exogenen PAM-präsentierenden Oligonukleotiden (PAMmern) die SpyCas9-Spaltung von Ziel-dsDNA ohne PAM stimulierte., Diese Studie in Bezug auf PAM und SpyCas9 wird voraussichtlich unser Verständnis von SpyCas9 mit einem damit verbundenen Einfluss auf verwandte Bioengineering-Fähigkeiten verbessern.

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